Милдронат

Милдронат представитель класса аза-бутиробетаиновых соединений. Милдронат содержит четвертичный атом азота и отрицательно заряженный атом кислорода. 

Мельдоний частично ингибирует окисление жирных кислот и стимулирует использование глюкозы

Этот фармакологический механизм делает его эффективным при лечении острого ишемически-реперфузионного повреждения сердца и почек 

Кроме того, мельдоний показал потенциал в лечении инсульта, судорог, черепно-мозговой травмы и болезни Паркинсона

Рандомизированное двойное слепое многоцентровое клиническое исследование продемонстрировало эффективность инъекций мельдония при лечении острого церебрального инфаркта (ОЦИ)

Милдронат был создан для ингибирования биосинтеза карнитина с целью предотвращения накопления цитотоксических промежуточных продуктов β-окисления жирных кислот в ишемизированных тканях и блокирования этого процесса, потребляющего большое количество кислорода. Милдронат эффективен при лечении ишемии сердца и ее последствий. Обширная оценка фармакологической активности милдроната выявила его благотворное влияние на нарушения мозгового кровообращения и функции центральной нервной системы (ЦНС). Препарат используется в неврологических клиниках для лечения нарушений мозгового кровообращения. Он улучшает настроение пациентов; они становятся более активными, уменьшается двигательная дисфункция, а астения, головокружение и тошнота становятся менее выраженными. 

Наши недавние данные свидетельствуют о том, что эффекты милдроната на ЦНС могут быть опосредованы стимуляцией выработки оксида азота в сосудистом эндотелии путем модификации пулов γ-бутиробетаина и его эфиров. Предполагается, что милдронат может увеличивать образование эфиров γ-бутиробетаина. Последние являются мощными холиномиметиками и могут активировать eNOS через ацетилхолиновые рецепторы или специфические рецепторы эфиров γ-бутиробетаина.

Большая часть клинических преимуществ милдроната обусловлена его модуляцией метаболизма карнитина, который является важным фактором в регуляции клеточного энергетического метаболизма посредством β-окисления жирных кислот и гликолиза в миокарде, поскольку карнитин является ключевой молекулой в метаболизме жирных кислот в митохондриях. 

Однако при дефиците кислорода в клетке могут накапливаться цитотоксические промежуточные продукты из-за недостаточного снабжения кислородом. Снижение внутриклеточной концентрации свободного карнитина приводит к подавлению метаболизма жирных кислот и, следовательно, усиливает гликолиз во время ишемии, что оказывает цитопротекторное действие и повышает эффективность генерации АТФ, поскольку окисление углеводов требует меньше кислорода на молекулу АТФ, чем β-окисление свободных жирных кислот.

В спортивно-физиологическом аспекте были опубликованы отчеты о положительном влиянии на физическую работоспособность элитных спортсменов, а также обсуждались дозировки Милдроната (перорально от 0,25 до 1,0 г два раза в день в течение 2–3 недель в тренировочный период и за 10–14 дней до соревнований). 

Дальнейшие исследования продемонстрировали повышение выносливости спортсменов, улучшение реабилитации после тренировок, защиту от стресса и усиление активации функций центральной нервной системы (ЦНС). 15 , 16 Более того, Милдронат оказывает улучшающее настроение действие, а также повышает способность к обучению и память, что также может принести пользу спортсменам. 

Милдронат, препарат, родственный карнитину, ранее продемонстрировал нейропротекторное действие в мышиной модели нейротоксичности, вызванной азидотимидином, и в крысиной модели болезни Паркинсона. Целью данного исследования было изучение влияния лечения милдронатом на когнитивные функции и патологию у мышей с моделью болезни Альцгеймера (БА) (APP SweDI ). Милдронат вводили внутрибрюшинно ежедневно в дозе 50 или 100 мг/кг в течение 28 дней. По окончании лечения животных тестировали на поведенческие и когнитивные функции, а также оценивали мозг на предмет патологии, связанной с БА, воспаления, синаптических маркеров и активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ). Полученные данные показывают, что лечение милдронатом значительно улучшило показатели животных в тестах на водный лабиринт и социальное распознавание, снизило отложение амилоида-β в гиппокампе, увеличило экспрессию маркера микроглии Iba-1 и уменьшило окрашивание AChE, хотя и не изменило экспрессию.

Кроме того, лечение милдронатом эффективно нормализовало неврологические нарушения и уменьшило размер инфаркта в модели ишемического инсульта, вызванного эндотелином-1, у крыс.

Также ранее было показано, что милдронат действует как митохондриальный защитный агент, особенно на уровне комплекса I.

антиишемический препарат, механизм действия которого основан на ингибировании биосинтеза и усвоения L-карнитина. L-карнитин играет ключевую роль в сбалансированном метаболизме жирных кислот и углеводов,

Лечение милдронатом значительно снизило концентрацию L-карнитина в плазме крыс и постепенно уменьшило уровень глюкозы в крови как в состоянии насыщения, так и натощак. Милдронат сильно подавлял накопление фруктозамина и потерю болевой чувствительности, а также смягчал повышенную сократительную реакцию колец аорты крыс GK на фенилэфрин. Кроме того, в сердцах, получавших милдронат, зона некроза после окклюзии коронарной артерии значительно уменьшилась на 30%.

результаты впервые демонстрируют, что у крыс GK, экспериментальной модели диабета 2 типа, милдронат снижал содержание L-карнитина и оказывал кардиопротекторное действие, снижал концентрацию глюкозы в крови и предотвращал потерю болевой чувствительности. 

L-карнитин также стимулировал окисление глюкозы в интактном сердце крысы, перфузированном жирными кислотами ( Broderick et al. , 1992 ). Более того, считается, что добавки L-карнитина полезны для пациентов с диабетом ( Mingrone, 2004 ). Недавно было показано, что системный дефицит L-карнитина вызывает тяжелую гипогликемию у мышей.

сообщили, что милдронат снижает концентрацию L-карнитина и глюкозы в плазме крови, стимулирует поглощение глюкозы и экспрессию генов, связанных с метаболизмом глюкозы, в сердце мышей.

Был сделан вывод, что милдронат вызывает снижение содержания L-карнитина, что приводит к стимуляции поглощения глюкозы.

концентрация L-карнитина в плазме крыс GK была на 25% ниже, чем у контрольных крыс (Wistar). Лечение милдронатом в дозах 100 и 200 мг·кг⁻¹ в течение 8 недель привело к значительному снижению концентрации L-карнитина на 85% и 95% соответственно.

концентрация фруктозамина у контрольных крыс GK была значительно выше, чем у крыс Wistar. В свою очередь, 8-недельное лечение милдронатом в любой дозе значительно снизило уровень фруктозамина в крови крыс GK до значений, близких к наблюдаемым у крыс Wistar 

Напротив, в конце эксперимента уровень инсулина у контрольных крыс GK был менее чем вдвое ниже, чем у крыс Wistar, и лечение милдронатом не вызвало каких-либо существенных изменений

лечение милдронатом значительно повысило концентрацию холестерина ЛПВП у крыс GK, но не повлияло на другие параметры.

В начале эксперимента концентрация β-гидроксибутирата у крыс Wistar и GK была схожей ( рис. 2 ). У крыс Wistar концентрация β-гидроксибутирата не изменялась в течение эксперимента. Однако у контрольных крыс GK она была значительно ниже, чем у крыс Wistar, через 4 и 8 недель.

В начале эксперимента концентрация β-гидроксибутирата у крыс Wistar и GK была схожей ( рис. 2 ). У крыс Wistar концентрация β-гидроксибутирата не изменялась в течение эксперимента. Однако у контрольных крыс GK она была значительно ниже, чем у крыс Wistar, через 4 и 8 недель. По сравнению с контрольными крысами GK, лечение милдронатом в дозе 200 мг·кг⁻¹ значительно снизило концентрацию β-гидроксибутирата в группе через 4 и 8 недель лечения.

Для измерения изменений в восприятии периферической термической боли у крыс GK в конце 8-недельного лечения был проведен тест на отдергивание хвоста. Как видно на рисунке 3 , у контрольных крыс GK наблюдалась на 40% большая латентность отдергивания хвоста (12,6 с), чем у контрольных крыс Wistar (7,2 с). Этот эффект был значительно ослаблен (на 75%) при введении милдроната в дозе 200 мг·кг⁻¹ . Лечение милдронатом в дозе 100 мг·кг⁻¹ не вызвало значительных изменений времени латентности отдергивания хвоста у крыс GK.

Также была исследована эндотелий-опосредованная сосудистая релаксация колец брыжеечных артерий, предварительно сокращенных норадреналином, в ответ на ацетилхолин. Реакция артериальных колец на ацетилхолин была сходной у крыс Wistar и контрольных крыс GK, а длительное лечение милдронатом не вызывало никаких изменений (данные не показаны).

После 8 недель лечения милдронатом в дозе 200 мг·кг −1 наблюдалось значительное улучшение коронарного кровотока в сердцах крыс GK

Во время окклюзии левой коронарной артерии коронарный кровоток во всех экспериментальных группах снизился на 40% (с 11 до 7 мл·мин⁻¹ ) . Кроме того, наблюдалось снижение ЛДДП примерно с 50 до 25 мм рт. ст. Частота сердечных сокращений в период окклюзии существенно не изменилась. Во время реперфузии коронарный кровоток, ЛДДП и значения ±dp/dt восстановились примерно до 80% от контрольных значений. Значимых различий между группами Wistar, контрольной группой GK и группой, получавшей милдронат, не наблюдалось.

исследование показало, что длительное лечение милдронатом дозо- и времязависимо снижало уровень глюкозы в крови как натощак, так и после приема пищи, не повышая при этом уровень инсулина 

обнаружили, что инъекции L-карнитина могут защитить от истощения мтДНК, способствуя митохондриальному биогенезу. Однако они также, по-видимому, усугубляли воспалительные реакции, вероятно, из-за изменений в составе кишечной микробиоты. С другой стороны, милдронат усиливал экспрессию генов, связанных с ангиогенезом, одновременно снижая местное и системное воспаление. Таким образом, оба соединения, несмотря на противоположные метаболические эффекты, потенциально могут быть использованы для лечения вторичных повреждений, вызванных черепно-мозговой травмой.

Милдронат ингибирует биосинтез карнитина, предотвращая накопление токсичных промежуточных продуктов окисления жирных кислот в ишемизированных тканях и компенсаторно активируя процесс окисления глюкозы. Благодаря этим свойствам милдронат эффективен при лечении ишемии сердца и ее последствий.

Однако было также обнаружено, что он оказывает благотворное влияние на мозговой кровоток и функциональность центральной нервной системы (ЦНС).

У мышей, получавших милдронат после ЧМТ, экспрессия фактора роста эндотелия сосудов А ( Vegfa ) оказалась в два раза выше по сравнению с мышами, получавшими инъекции L-карнитина после ЧМТ.

Самые высокие уровни экспрессии воспалительных маркеров, таких как интерлейкин 1 бета ( Il1b ), интерлейкин 6 ( Il6 ), фактор некроза опухоли ( Tnf ), Ptgs2 и Gfap, наблюдались в крови мышей, получавших инъекции L-карнитина после черепно-мозговой травмы. В отличие от этого, у мышей, получавших инъекции милдроната, экспрессия этих генов была значительно ниже, чем у мышей, получавших инъекции L-карнитина.

Во всех экспериментальных группах преобладающими филумами были Bacteroidetes и Firmicutes . У мышей, подвергнутых краниотомии и ЧМТ, наблюдалась тенденция к снижению уровня Bacteroidetes по сравнению с контрольной группой, с уменьшением на 13,1% и 16,9% соответственно. У мышей, получавших милдронат, содержание Bacteroidetes увеличилось на 25% по сравнению с мышами, подвергшимися только ЧМТ ( рис. 6 А). Напротив, противоположные изменения наблюдались в филуме Firmicutes . У мышей, подвергнутых ЧМТ, уровень Firmicutes увеличился с 21% до 33,4%. Однако у мышей, получавших милдронат, уровень Firmicutes снизился до 18,6% ( p < 0,01 по сравнению с мышами, подвергшимися ЧМТ).

Лечение дефицита карнитина включает прием больших пероральных доз карнитина для нормализации β-окисления, но этого недостаточно для нормализации концентрации карнитина в тканях.

Милдронат) является аналогом предшественника карнитина γ-бутиробетаина, ингибируя гидроксилазу γ-бутиробетаина, подавляя биосинтез карнитина и приводя к снижению его концентрации [ 21 , 22 ]. Поскольку этот механизм стимулирует метаболизм глюкозы в сердце, он используется в качестве кардиопротекторного препарата [ 23 ]. Однако было показано, что снижение уровня карнитина в печени приводит к развитию жировой дистрофии печени у животных [ 22 , 24 ]. Таким образом, крысы, получавшие Милдронат, могут быть использованы в качестве модели истощения карнитина

Известно, что аналог бутиробетаина милдронат нарушает синтез карнитина в печени ( 25 , 31 ), ускоряет выведение карнитина с мочой in vivo ( 25 , 32 ) и снижает транспорт карнитина in vitro ( 33 , 34 ). Предыдущие исследования на грызунах показали, что милдронат снижает уровень карнитина в крови, сердце, печени и скелетных мышцах.

Здесь мы также показываем, что 4 недели лечения милдронатом значительно снижают все субфракции карнитина в скелетных мышцах и печени, при этом общая концентрация карнитина в печени на 90% ниже, а в скелетных мышцах на 97% ниже по сравнению с контрольными мышами. В частности, свободный карнитин – преобладающая форма карнитина в покоящихся мышцах – был практически полностью истощен, при этом уровень свободного карнитина в мышцах мышей, получавших милдронат, снизился примерно до 2% от уровня у контрольных мышей.

Несмотря на выраженное истощение карнитина в скелетных мышцах и печени мышей, получавших милдронат, митохондриальная дыхательная способность оставалась неизменной в обеих тканях. Кроме того, канонический путь Ingenuity для митохондриального β-окисления жирных кислот был значительно активирован во всех трех тканях в группе MIL.

Недавно мы продемонстрировали, что THP способен эффективно восстанавливать экспрессию коактиватора 1-альфа рецептора, активируемого пролифераторами пероксисом гамма (PGC-1α), главного регулятора биогенеза, динамики и окислительного метаболизма митохондрий, в клеточных и животных моделях болезни Хантингтона (БХ) 

Эти биологические свойства делают ТГП потенциально полезным средством лечения заболеваний, характеризующихся дисфункцией митохондриального окисления и биогенеза жирных кислот, таких как диабет, ангиокардиопатия и некоторые виды нейропатии. 

Однако было показано, что снижение уровня карнитина в печени, главным образом из-за ингибирования BBOX, приводит к развитию жировой дистрофии печени у животных 

 В недавней статье был предложен новый механизм, посредством которого бетаин 5-аминовалериановой кислоты (5-АВАБ), биоактивное соединение, присутствующее в рационах, богатых цельными злаками, может участвовать в регуляции клеточного энергетического метаболизма. Исследование показало, что 5-АВАБ, структурный аналог ТГП, способен снижать β-окисление жирных кислот за счет снижения внутриклеточного уровня карнитина путем блокирования OCTN2, не влияя при этом на биосинтез L- карнитина через BBOX.

THP улучшает контроль заболеваний, характеризующихся митохондриальной дисфункцией, включая нейродегенеративные заболевания.

В модели нейротоксичности азидотимидина у крыс милдронат подавлял нейровоспалительные и апоптотические процессы в ткани головного мозга, защищая от аномальной экспрессии цитохромоксидазы c, каспазы-3, iNOS, белка восприимчивости к клеточному апоптозу (CAS) и глиального фибриллярного кислого белка (GFAP).

Кроме того, данные наших предыдущих исследований показали, что милдронат играет защитную роль против повреждения митохондриального комплекса I, вызванного веществами, повреждающими митохондрии, такими как ротенон и анти-ВИЧ препарат азидотимидин

Иммуногистохимическое исследование ткани головного мозга ex vivo показало, что вызванные 6-OHDA поражения были связаны с массивной потерей нейронального дофамина, резким (пятикратным) уменьшением количества TH-позитивных нервных окончаний в поврежденном стриатуме и приблизительно 2,5-кратным уменьшением количества TH-позитивных нейронов в черной субстанции по сравнению с контрольной группой (физиологический раствор + искусственная спинномозговая жидкость). Введение милдроната в дозе 50 мг/кг обеспечило полную защиту от вызванной 6-OHDA дегенерации TH-позитивных нервных окончаний в поврежденном стриатуме. Кроме того, милдронат в дозе 100 мг/кг защитил от потери TH-позитивных дофаминергических нейронов в черной субстанции.

результаты показали, что 6-OHDA снижает количество Notch-3-положительных клеток в полосатом теле и черной субстанции крыс. Однако милдронат в дозе 50 мг/кг, вводимый одновременно с 6-OHDA, увеличивает количество Notch-3-положительных клеток до значений, близких к контрольным.

Наконец, в полосатом теле и черной субстанции, пораженных 6-OHDA, мы обнаружили значительное увеличение экспрессии воспалительного маркера iNOS, что указывает на проявление нейровоспалительных процессов. Аналогично, ранее в модели 6-OHDA наблюдалась повышенная экспрессия iNOS [ 53 ], что указывает на то, что индукция iNOS играет важную роль на начальной стадии нейродегенерации. Введение милдроната в дозе 50 мг/кг снизило экспрессию iNOS в черной субстанции примерно в два раза, что указывает на наличие у милдроната противовоспалительной активности.

результаты продемонстрировали способность милдроната полностью предотвращать (до уровня контроля) индуцированное 6-OHDA образование внутриклеточных включений убиквитина как в полосатом теле крысы, так и в черной субстанции. Повышенный уровень неконъюгированного убиквитина и образование внутриклеточных включений убиквитина в полосатом теле с дефицитом дофамина, вызванным 6-OHDA, наблюдаемые в настоящем исследовании, согласуются с данными, представленными в литературе [ 43 ]. Эффект милдроната позволяет предположить, что он способен регулировать убиквитин-протеасомный путь, вероятно, путем активации протеасомы и/или усиления убиквитинирования и, таким образом, содействия деградации белка. Объяснением этого эффекта может быть способность милдроната защищать клетки на уровне митохондрий [ 38 ], поскольку нарушения в производстве убиквитина в значительной степени зависят от вызванных окислительным стрессом нарушений глюколиза и митохондриального дыхания [ 44 ]. Все большее признание получает центральная роль убиквитин-протеасомной системы в регуляции деградации клеточных белков в различных физиологических условиях.

Мельдоний значительно уменьшил размер инфаркта, улучшил неврологическую функцию и двигательные способности, а также подавил апоптоз нейронов in vivo. Мельдоний улучшил морфологию, антиоксидантную способность и выработку АТФ митохондриями, а также подавил открытие митохондриальной поры проницаемости в коре головного мозга и гиппокампе во время церебральной ишемически-реперфузионного повреждения (CIRI) у крыс. Кроме того, мельдоний улучшил поврежденный процесс слияния и дыхательную функцию нейрональных митохондрий in vitro. Дальнейшие исследования показали, что мельдоний активировал сигнальный путь Akt/GSK-3β для подавления митохондриально-зависимого апоптоза нейронов.

Белок

Окисление жирных кислот в митохондриях снизилось на 33,1–88,9% (печень) и 55,6–68,8% (мышцы) у нильской тилапии с дефицитом карнитина и у данио-рерио с дефицитом cpt1b по сравнению с контрольной группой ( P < 0,05). Примечательно, что окисление глюкозы и отложение мышечного белка увеличились на 20,5–24,4% и 6,40–8,54% соответственно в двух моделях рыб по сравнению с соответствующими контрольными группами. Соответственно, сигнальный путь AMPK/AKT-mTOR (аденозин-5'-монофосфат-активированная протеинкиназа/протеинкиназа B-механистическая мишень рапамицина) был значительно активирован в двух моделях рыб с ингибированным окислением жирных кислот в митохондриях. 

Накопленные данные исследований млекопитающих показывают, что потеря митохондриального β-окисления жирных кислот (FAO) активирует протеинкиназу, активируемую аденозин-5'-монофосфатом (AMPK), что, в свою очередь, увеличивает утилизацию глюкозы за счет активации сигнального пути инсулина протеинкиназы B (AKT) 

В настоящем исследовании мы создали две модели рыб с ингибированной митохондриальной FAO: нильскую тилапию с дефицитом карнитина и данио- рерио с дефицитом cpt1b . Эти модели рыб показали сходное умеренное накопление липидов с индуцированными компенсаторными метаболическими реакциями, включая усиление пероксисомального окисления жирных кислот, митохондриального биогенеза и экспрессии генов FAO. Эти результаты согласуются с результатами, полученными на моделях млекопитающих с дефицитом митохондриальной FAO ( 6–8 ) , подтверждая сходные фенотипы в метаболизме липидов у животных с ингибированной митохондриальной FAO. Однако, насколько нам известно, наше настоящее исследование впервые указывает на то, что регуляция энергетического гомеостаза является многообещающей стратегией для производства белка у культивируемых животных, по крайней мере, у рыб. Механизмы, суммирующие системную перестройку энергетического гомеостаза, вызванную ингибированием митохондриальной FAO.

Следует отметить, что по сравнению с млекопитающими рыбы традиционно считаются неэффективными в использовании глюкозы в качестве топлива и предпочитают использовать белок в качестве основного источника энергии.

 В настоящем исследовании мы обнаружили, что ингибирование митохондриального FAO снижает концентрацию глюкозы и инсулина в крови , а также содержание гликогена в тканях. Кроме того, с помощью теста на толерантность к глюкозе (GTT) у рыб с ингибированным митохондриальным FAO было обнаружено увеличение клиренса глюкозы in vivo, а с помощью теста на эффективность синтеза гликогена, стимулированного инсулином, in vitro была повышена чувствительность к инсулину. 

Более того, во время теста на отслеживание глюкозы с помощью 14C у рыб с ингибированным митохондриальным FAO повысилась способность к окислению глюкозы. Эти данные убедительно свидетельствуют об улучшении окисления глюкозы и чувствительности к инсулину у рыб с ингибированным митохондриальным FAO, что согласуется с данными, полученными на мышах.

Было установлено, что мельдоний оказывает свое терапевтическое воздействие на нейроны OGD/R в первую очередь посредством активации сигнального пути Akt/GSK-3β, тем самым ингибируя митохондриально-зависимый апоптоз нейронов.

Мельдоний, ведущий сердечно-сосудистый препарат, особенно используемый при стенокардии и сердечной недостаточности, подвергся обширным исследованиям на предмет его потенциального защитного механизма против ишемического повреждения и улучшения когнитивных функций [ 57 ]. Он сохраняет сердечную саркоплазматическую ретикулярную Ca2 + -АТФазу и гексокиназу типа I во время инфаркта миокарда, проявляя кардиопротекторное действие за счет активации NO-синтетазы, которая стимулирует синтез GBB.

Несколько исследований показали, что кардиопротекторные механизмы мельдония связаны с облегчением метаболизма глюкозы, тем самым поддерживая функцию митохондрий. Кроме того, многочисленные исследования подчеркнули значительную роль мельдония в различных заболеваниях ЦНС. Мельдоний регулирует экспрессию белков нервных и глиальных клеток у крыс с болезнью Паркинсона и уменьшает отложение амилоида в гиппокампе у мышей с болезнью Альцгеймера.

Он также может смягчать патологическое повреждение тканей головного мозга у мышей с нейротоксической моделью, вызванной зидовудином, регулировать экспрессию белков, связанных с обучением и памятью, в двух классических моделях амнезии (стрессовая и галоперидоловая модели) у крыс [ 62 ] и улучшать функцию нервов в модели ишемического инсульта у крыс, вызванного эндотелином-1.

Согласно исследованию, мы доказали, что мельдоний может улучшать неврологические функции, значительно уменьшать патологическое повреждение нейронов в коре и гиппокампе, а также снижать объем инфаркта у крыс с окклюзией средней мозговой артерии (MCAO). 

В исследовании было показано, что время удержания у крыс с MCAO значительно увеличивается под действием мельдония, что предполагает, что препарат может оказывать положительное влияние на двигательную функцию.

Механистически, мельдоний подавляет чрезмерное деление митохондрий и потерю ∆ψm, поддерживая их морфологию и дыхательную функцию. 

Печень

Острое ишемически-реперфузионное (И/Р) повреждение печени — это сложное для лечения клиническое состояние. Мельдоний — это антиишемический агент, который переключает производство энергии с окисления жирных кислот на менее потребляющий кислород гликолиз. Поэтому мы исследовали влияние 4-недельного предварительного лечения мельдонием (300 мг/кг массы тела/день) на острое И/Р повреждение печени у самцов крыс линии Вистар. Наши результаты показали, что мельдоний уменьшает вызванное И/Р воспаление и повреждение печени, что подтверждается гистологическим исследованием печени, а также снижением активности аланин- и аспартатаминотрансферазы в сыворотке, экспрессии белка высокой подвижности группы 1 в сыворотке и печени, а также экспрессии в печени Bax/Bcl2, гаптоглобина и фосфорилированного ядерного фактора каппа-легкой цепи-усилителя активации В-клеток. 

Таким образом, мельдоний защищает митохондрии от накопления токсичных промежуточных продуктов длинноцепочечных жирных кислот¹³ и переключает производство энергии на гликолиз, который менее потребляет кислорода по сравнению с окислением жирных кислот и, следовательно, более благоприятен в условиях ишемии.

Результаты показывают, что мельдоний снижает концентрацию карнитина, глицерола и жирных кислот в печени как в контрольной группе, так и в группе крыс с ишемией/реперфузией, а также увеличивает содержание триглицеридов у животных, перенесших операцию по поводу ишемии/реперфузии.

Кроме того, вызванное ишемией/реперфузией увеличение концентрации лактата в печени было снижено мельдонием на 30%, и тот же эффект наблюдался у животных, перенесших операцию по поводу ишемии/реперфузии (снижение на 50% по сравнению с контрольной группой). Следует отметить, что мельдоний также снижает содержание глюкозы у животных контрольной группы и животных, перенесших ишемически-реперфузионную операцию (таблица 1 ), что согласуется с литературными данными, показывающими увеличение поглощения глюкозы и снижение концентрации лактата в сердце мышей, получавших мельдоний.

Таким образом, вызванное ишемией/реперфузией снижение содержания триглицеридов в печени на 50%, наряду с увеличением концентрации печеночного глицерина, жирных кислот и карнитина (таблицы 1 и 2 ), указывает на усиление липолиза в печени и β-окисления жирных кислот. Вероятно, это компенсаторная реакция на нарушение выработки АТФ из-за субстратного гликолиза, и тот же эффект был описан в ишемизированном/реперфузированном сердце.

Кроме того, вызванное ишемией/реперфузией увеличение концентрации лактата в печени было снижено мельдонием на 30%, и тот же эффект наблюдался у животных, перенесших операцию по поводу ишемии/реперфузии (снижение на 50% по сравнению с контрольной группой). 

Просмотреть на значке сайта издателя

Значок загрузки PDF

значок коллекций

иконка цитирования

Показать значок постоянной ссылки на статьюЗначок открытой навигации по статье

Как библиотека, NLM предоставляет доступ к научной литературе. Включение в базу данных NLM не подразумевает одобрения или согласия с содержанием со стороны NLM или Национальных институтов здравоохранения.

Подробнее: Заявление об отказе от ответственности PMC | Уведомление об авторских правах PMC

Логотип Scientific Reports

Научный отчет. 2021, 14 января;11:1305. doi: 10.1038/s41598-020-80011-y

Влияние мельдония на острое ишемически-реперфузионное повреждение печени у крыс

Синиша Джурашевич 1, ✉ , Майя Стойкович 2 , Елена Сопта 2 , Сладан Павлович 3 , Славица Боркович-Митич 3 , Анжелия Иванович 3 , Небойша Яснич 1 , Томислав Тости 4 , Саша Джурович 5 , Елена Дордевич 1 , Зоран Тодорович 2, 6

Информация об авторе

Примечания к статье

Информация об авторских правах и лицензиях

PMCID: PMC7809046 PMID: 33446709

Абстрактный

Острое ишемически-реперфузионное (И/Р) повреждение печени — это сложное для лечения клиническое состояние. Мельдоний — это антиишемический агент, который переключает производство энергии с окисления жирных кислот на менее потребляющий кислород гликолиз. Поэтому мы исследовали влияние 4-недельного предварительного лечения мельдонием (300 мг/кг массы тела/день) на острое И/Р повреждение печени у самцов крыс линии Вистар. Наши результаты показали, что мельдоний уменьшает вызванное И/Р воспаление и повреждение печени, что подтверждается гистологическим исследованием печени, а также снижением активности аланин- и аспартатаминотрансферазы в сыворотке, экспрессии белка высокой подвижности группы 1 в сыворотке и печени, а также экспрессии в печени Bax/Bcl2, гаптоглобина и фосфорилированного ядерного фактора каппа-легкой цепи-усилителя активации В-клеток. Благодаря усиленной активации ядерного фактора эритроидного 2-связанного фактора 2 в печени, мельдоний улучшает антиоксидантную защиту печени животных, подвергнутых ишемии/реперфузии, что подтверждается увеличением соотношения аскорбиновой/дегидроаскорбиновой кислоты в сыворотке и печени, экспрессии гемоксигеназы 1 в печени, содержания глутатиона и свободных тиольных групп, а также активности медно-цинковой супероксиддисмутазы, марганцевой супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы в печени. На основании полученных результатов можно заключить, что мельдоний представляет собой защитное средство против ишемически-реперфузионного поражения печени, имеющее клиническое значение при хирургических вмешательствах.

Ключевые слова: Печень, Разработка лекарств, Физиология

Введение

Острая ишемия/реперфузия (И/Р) — это временное прекращение кровотока во время хирургических вмешательств с последующим его восстановлением после завершения вмешательства¹ . И/Р повреждает пораженные ткани посредством многочисленных патологических процессов, таких как воспаление, окислительный стресс, нарушение клеточных сигнальных путей, а также апоптоз и некроз клеток² . Молекулярные пути печеночной И/Р начинаются с увеличения образования активных форм кислорода (АФК) во время ишемической фазы. Повреждение клеток, вызванное АФК, приводит к высвобождению молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMP), таких как белок HMGB1 (high mobility group Box 1 protein), который, как известно, вызывает воспаление путем активации пути ядерного фактора каппа-легкой цепи-усилителя активации В-клеток (NF-κB p65) ³ . В результате высвобождения воспалительных цитокинов и хемокинов происходит последующая активация провоспалительных нейтрофилов, которые еще больше усиливают разрушение тканей⁴ .

Существует несколько возможных терапевтических вариантов лечения ишемически-реперфузионного поражения печени, таких как сохранение органа, ингибирование образования АФК или модуляция активации иммунной системы⁵ . Хотя стратегия сохранения органа показала наиболее многообещающие результаты⁶ , использование ингибиторов ФНО⁷ , кортикостероидов⁸ или поглотителей свободных радикалов, таких как N -ацетилцистеин⁹ , в большинстве случаев было безуспешным или имело ограниченный успех. В нашей предыдущей работе на модели почечной ишемии-реперфузии мы показали, что мельдоний, клинический препарат, используемый для лечения ишемических состояний миокарда и головного мозга¹⁰ , обладает противовоспалительными свойствами¹¹ . Он ингибирует синтез и транспорт карнитина, нарушая транспорт цитозольных длинноцепочечных жирных кислот (ЖК) в митохондрии и перенаправляя их в пероксисомы¹² . Таким образом, мельдоний защищает митохондрии от накопления токсичных промежуточных продуктов длинноцепочечных жирных кислот¹³ и переключает производство энергии на гликолиз, который менее потребляет кислорода по сравнению с окислением жирных кислот и, следовательно, более благоприятен в условиях ишемии.

По этим причинам защитный эффект четырехнедельного предварительного лечения мельдонием в дозе 300 мг/кг массы тела/день был исследован на модели ишемии-реперфузии печени у крыс. Эта доза была выбрана, поскольку она аналогична клиническому применению у человека 14 , 15 и находится в диапазоне ранее изученных доз мельдония для животных 16 , где она оказалась как высокоэффективной, так и безопасной. В качестве общего маркера метаболического действия мельдония измеряли концентрацию глюкозы, молочной кислоты, карнитина, жирных кислот и глицерина в печени. Степень повреждения печени оценивали по гистологическому исследованию тканей, активности аланин-аминотрансферазы (АЛТ), аспартат-аминотрансферазы (АСТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови, активации NF-κB p65 путем фосфорилирования и экспрессии регулируемого NF-κB p65 белка острой фазы гаптоглобина (Hp). Соотношение Bax и Bcl-2 в печени, а также уровни HMGB1 в сыворотке и печени измерялись в качестве маркеров апоптотической и некротической гибели клеток. Антиоксидантная защита печени исследовалась путем мониторинга активации ядерного фактора эритроидного 2-связанного фактора 2 (Nrf2) посредством фосфорилирования и экспрессии регулируемого Nrf2 антиоксидантного фермента гемоксигеназы 1 (HO-1), а также путем измерения активности медь-цинковой супероксиддисмутазы (CuZnSOD), марганцевой супероксиддисмутазы (MnSOD), каталазы (CAT), глутатионпероксидазы (GSH-Px), глутатионредуктазы (GR) и глутатион-S-трансферазы (GST), концентрации свободных сульфгидрильных групп (SH) и глутатиона (GSH), а также уровня перекисного окисления липидов (тиобарбитуровая кислота-реактивные вещества, TBARS). Аскорбиновая кислота является хорошо известным эффектором антиоксидантной системы, поэтому наш эксперимент также включал определение концентрации аскорбиновой кислоты (АК) и дегидроаскорбиновой кислоты (ДГК) в сыворотке крови, надпочечниках и печени. Поскольку связь между аскорбиновой кислотой и выработкой катехоламинов в надпочечниках хорошо известна 17 , 18 , мы также определили концентрации норадреналина (НА) и адреналина (АД) в надпочечниках.

Результаты и обсуждение

Наше открытие, что ишемия/реперфузия (И/Р) увеличивает концентрацию молочной кислоты в печени на 50% (таблица 1 ), предполагает, что вместо окислительного фосфорилирования, удовлетворяющего потребность в АТФ, гликолиз ускоряет производство АТФ на субстратном уровне во время И/Р. В аэробных условиях пируват, как конечный продукт гликолиза, поступает в цикл Кребса, избегая образования лактата¹⁹ . Однако в анаэробных условиях, как в случае И/Р, он превращается лактатдегидрогеназой в молочную кислоту²⁰ . Тот факт, что содержание глюкозы в печени не изменилось после И/Р (таблица 1 ), вероятно, является результатом короткой продолжительности И/Р и в остальном высокого содержания глюкозы в печени.

Открыть в новой вкладке

Сокращения названий экспериментальных групп: S — группа крыс, перенесших ложную операцию; S + M — группа крыс, перенесших ложную операцию и получавших мельдоний; I/R — группа крыс, перенесших ишемию/реперфузию; I/R + M — группа крыс, перенесших ишемию/реперфузию и получавших мельдоний. Количество животных в каждой экспериментальной группе: n = 8. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Минимальный уровень значимости: p < 0,05. Значимые различия: а) по отношению к группе S; б) по отношению к группе I/R.

Карнитин необходим для митохондриального β-окисления, поскольку длинноцепочечные жирные ацил-КоА должны быть преобразованы в жирные ацил-карнитин с помощью карнитинпальмитоилтрансферазы I для транспортировки через внешнюю митохондриальную мембрану, а затем для дальнейшей транспортировки с помощью карнитин-ацилкарнитинтранслоказы через внутреннюю мембрану. Попав внутрь митохондриального матрикса, жирные ацил-карнитин повторно преобразуются в жирные ацил-КоА с помощью карнитинпальмитоилтрансферазы II, становясь готовыми к производству АТФ посредством β-окисления. Таким образом, вызванное ишемией/реперфузией снижение содержания триглицеридов в печени на 50%, наряду с увеличением концентрации печеночного глицерина, жирных кислот и карнитина (таблицы 1 и 2 ), указывает на усиление липолиза в печени и β-окисления жирных кислот. Вероятно, это компенсаторная реакция на нарушение выработки АТФ из-за субстратного гликолиза, и тот же эффект был описан в ишемизированном/реперфузированном сердце 21 , 22 .

Таблица 2.

Концентрация жирных кислот в печени (мкг/мг ткани).

Открыть в новой вкладке

Сокращения названий экспериментальных групп: S — группа крыс, перенесших ложную операцию; S + M — группа крыс, перенесших ложную операцию и получавших мельдоний; I/R — группа крыс, перенесших ишемию/реперфузию; I/R + M — группа крыс, перенесших ишемию/реперфузию и получавших мельдоний. Количество животных в каждой экспериментальной группе: n = 8. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Минимальный уровень значимости: p < 0,05. Значимые различия: а) по отношению к группе S; б) по отношению к группе I/R.

Будучи аналогом γ-бутиробетаина, мельдоний ингибирует активность γ-бутиробетаингидроксилазы, фермента, катализирующего образование L -карнитина²³ , и почечную реабсорбцию L- карнитина²⁴ . Наши результаты показывают, что мельдоний снижает концентрацию карнитина, глицерола и жирных кислот в печени как в контрольной группе, так и в группе крыс с ишемией/реперфузией, а также увеличивает содержание триглицеридов у животных, перенесших операцию по поводу ишемии/реперфузии (таблицы 1 и 2 ). Кроме того, вызванное ишемией/реперфузией увеличение концентрации лактата в печени было снижено мельдонием на 30%, и тот же эффект наблюдался у животных, перенесших операцию по поводу ишемии/реперфузии (снижение на 50% по сравнению с контрольной группой). Следует отметить, что мельдоний также снижает содержание глюкозы у животных контрольной группы и животных, перенесших ишемически-реперфузионную операцию (таблица 1 ), что согласуется с литературными данными, показывающими увеличение поглощения глюкозы и снижение концентрации лактата в сердце мышей, получавших мельдоний.

В этом смысле наши результаты указывают на то, что мельдоний снижает липолиз в печени и β-окисление жирных кислот, а также стимулирует аэробное окисление глюкозы как кислородсберегающий механизм для производства АТФ в условиях ишемии.

Аспартатаминотрансфераза и щелочная фосфатаза — это ферменты, присутствующие в различных тканях, включая печень, мозг, поджелудочную железу, сердце, почки, легкие и скелетные мышцы 65. Следовательно, если какая-либо из этих тканей повреждена, АСТ и ЩФ будут высвобождаться в кровоток. Наши результаты показали, что ишемия/реперфузия вызывает 16-кратное увеличение активности АЛТ и АСТ и 1,6-кратное увеличение активности ЩФ (таблица 5 ), что согласуется с литературными данными, показывающими, что ишемия/реперфузия вызывает гораздо большее увеличение активности сывороточных АЛТ и АСТ, чем ЩФ 66. В то время как у животных, подвергшихся ложной операции, мельдоний снижает активность всех трех ферментов, у животных с ишемией/реперфузией он снижает активность только АЛТ. Возможно, объяснением может служить тот факт, что АЛТ, обладающая наибольшей активностью в гепатоцитах и низкой в других тканях, является гораздо лучшим маркером повреждения гепатоцитов, чем АСТ или ЩФ, которые имеют схожую активность в печени и многих непеченочных тканях.

Сокращения названий экспериментальных групп: S — группа крыс, перенесших ложную операцию, S + M — группа крыс, перенесших ложную операцию.

На основании результатов гистологического анализа печени можно сделать вывод, что у животных, подвергшихся ложной операции, мельдоний ухудшает гистологический профиль печени, доказательством чего является более высокий гистологический балл по шкале Сузуки у образцов из группы S + M по сравнению с образцами из группы S (таблица 6 ). В то время как образцы из группы S демонстрируют умеренную дезорганизацию печеночных тяжей, интенсивный интерстициальный отек, умеренную экстравазацию эритроцитов в синусоидальные пространства (желтая стрелка), интенсивную и диффузную паренхимальную вакуолизацию с нерегулярными контурами ядер, конденсацию хроматина, пикноз и ядерную пыль во многих гепатоцитах, а также отсутствие двуядерных гепатоцитов (красная стрелка) (рис. 2 А), образцы из группы S + M показывают интенсивную дезорганизацию печеночных тяжей, связанную с выраженным интерстициальным отеком, диффузной и выраженной цитоплазматической вакуолизацией в виде микрососудистой дегенерации (черная стрелка), регулярные ядра без признаков конденсации хроматина, пикноз, ядерную пыль и очагово присутствующие двуядерные гепатоциты (красная стрелка) (рис. 2 В). Хотя вакуолярная дегенерация, наблюдаемая в группе S + M, представляет собой неспецифический маркер повреждения печени, можно обсудить возможную роль биотрансформации мельдония в печени как потенциальной причины этого явления 15. Однако следует подчеркнуть, что более выраженные и интенсивные цитоплазматические изменения в группе S + M все же обратимы, без повреждения ядра, в отличие от гистологических изменений в образцах из группы S, которые указывают на повреждение клеток без регенерации.

Было показано, что кратковременное лечение милдронатом вызывало компенсаторное увеличение экспрессии генов LPL , CPT-Iα и β , mtGPAT , DGAT , CTPpct и apoB в сердце [ 4 , 14 ]. Длительное лечение милдронатом вызывало компенсаторное увеличение экспрессии Acox1 в печени и головном мозге и экспрессии Acadl в печени [ 15 ]. Повышенная экспрессия cpt1 и ehhadh наблюдалась в печени Danio rerio , получавших милдронат [ 16 ]. В этом эксперименте мы наблюдали в среднем двукратное увеличение экспрессии генов, кодирующих различные ацетил-КоА-дегидрогеназы, а также ацетил-КоА-оксидазу в яичках мышей, получавших Милдронат, по сравнению с мышами, получавшими L-карнитин, что может указывать на то, что компенсаторные эффекты от ингибирования синтеза и реабсорбции L-карнитина влияют на экспрессию генов не только в сердце, печени и мозге, но и в яичках.